KIT ELISA RNA doub-chaj (dsRNA).

Twous sa a se yon Anzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kouple ak sistèm biotin-Streptavidin, pou mezi quantitative dsRNA ak longè pi wo pase 60 pè baz (bp), kèlkeswa sekans lan.Plak la te pre-kouvwi ak anti-dsRNA antikò.dsRNA prezan nan echantiyon an ajoute epi li mare nan antikò ki kouvri sou pwi yo.Apre sa, yo ajoute antikò biotinylate anti-dsRNA epi li mare nan dsRNA nan echantiyon an.Apre lave, yo ajoute HRP-Streptavidin epi li mare nan antikò anti-dsRNA Biotinylated la.Apre enkubasyon, HRP-Streptavidin yo lave.Lè sa a, solisyon substrate TMB ajoute ak katalize pa HRP pou pwodwi yon pwodwi koulè ble ki chanje an jòn apre yo fin ajoute solisyon asid sispann.Dansite jòn se pwopòsyonèl ak kantite sib dsRNA kaptire nan plak la.Absorbans la mezire nan 450 nm.

Aplikasyon

Twous sa a se pou mezi quantitative dsRNA rezidyèl.

Konpozan twous

Depo ak estabilite

1. Pou twous ki pa itilize: twous la an antye ka estoke nan 2 ~ 8 ℃ nan lavi etajè.Limyè fò yo ta dwe evite pou estabilite depo.

2. Pou twous yo itilize: Yon fwa yo ouvri mikwoplak la, tanpri kouvri pwi ki pa itilize yo ak sele plak epi retounen nan sak la papye ki gen pake desiccant la, zip-sele sak la papye epi retounen nan 2 ~ 8 ℃ pi vit ke posib apre yo fin itilize.Lòt reyaktif yo ta dwe retounen nan 2 ~ 8 ℃ pi vit ke posib apre yo fin itilize.

Materyèl ki obligatwa men ki pa apwovizyone

1. Microplate lektè ak 450±10nm filtre (pi bon si ka detekte nan 450 ak 650 nm longèdonn).

2. Microplate shaker.

3. Konsèy RNase-gratis ak tib santrifujeur.

Organigram Operasyon

Anvan w kòmanse

1. Pote tout konpozan twous ak echantiyon yo nan tanperati chanm (18-25 ℃) anvan ou itilize.Si twous la pa pral itilize nan yon sèl fwa, tanpri sèlman retire bann ak reyaktif pou eksperyans prezan, epi kite bann rès yo ak reyaktif nan kondisyon yo mande yo.

2. Tanpon lave: delye 40mL nan 20 × tanpon lave konsantre ak 760mL nan dlo deyonize oswa distile pou prepare 800mL nan 1 × tanpon lave.

3. Creole: yon ti tan vire oswa santrifuje solisyon an stock anvan ou itilize.Konsantrasyon kat estanda yo bay se 5ng/μL.Pou estanda UTP ak pUTP dsRNA, tanpri delye solisyon stock la nan 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL ak tanpon STE pou trase koub estanda a.Pou estanda N1-Me-pUTP dsRNA, tanpri delye solisyon stock la nan 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ak tanpon STE pou trase koub estanda a.Pou 5-OMe-UTP dsRNA estanda, tanpri delye solisyon an stock nan 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL ak tanpon STE trase koub estanda a.Nou rekòmande estanda yo ka dilye tankou tablo sa yo:

4. Biotinylate deteksyon antikò ak HRP-streptavidin k ap travay solisyon: yon ti tan vire oswa santrifuje solisyon an stock anvan ou itilize.Delye yo nan konsantrasyon travay la ak tanpon dilution.

5. TMB substate: aspire dòz ki nesesè nan solisyon an ak konsèy esterilize epi pa jete solisyon rezidyèl la nan flakon an ankò.TMB substate sansib a limyè, pa ekspoze substra TMB a limyè pou yon tan long.

Sèvi ak pwotokòl

1. Detèmine kantite bann ki nesesè pou tès la.Mete bann yo nan ankadreman yo pou itilize.Bann plak ki rete yo pa itilize nan tès sa a ta dwe repacked nan sak la ak desiccant.Fèmen sak la byen sere pou depo nan frijidè.

2. Ajoute 100μL chak nan dilusyon estanda, vid ak echantiyon nan pwi ki apwopriye yo.Kouvri ak plak sele a.Enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak souke nan 500rpm.Echantiyon yo ta dwe dilye ak tanpon STE nan konsantrasyon apwopriye pou tès egzat.

3. Etap lave: Aspire solisyon an epi lave ak 250μL tanpon lave nan chak pi epi kite l kanpe pou 30s.Jete tanpon lave nèt lè w mete plak la sou papye absòbe.Totalman lave 4 fwa.

4. ajoute 100μL de biotinylate deteksyon antikò travay solisyon nan chak pi.Kouvri ak plak sele a.Enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak souke nan 500rpm.

5. Repete etap lave.

6. Ajoute 100μL solisyon travay HRP-streptavidin nan chak pi.Kouvri ak plak sele a.Enkube pou 30min nan tanperati chanm ak souke nan 500rpm.

7. Repete etap lave ankò.

8. Ajoute 100μL solisyon substrate TMB nan chak pi.Kouvri ak plak sele a.Enkube pou 30 minit nan RT Pwoteje soti nan limyè.Likid la pral vire ble pa adisyon nan solisyon substra.

9. Ajoute 50μL solisyon sispann nan chak pi.Likid la ap vire jòn lè yo ajoute solisyon sispann.Lè sa a, kouri lektè a microplate epi fè mezi nan 450nm imedyatman.

Kalkil rezilta yo

1. Mwayèn lekti kopi yo pou chak estanda, kontwòl, ak echantiyon epi soustraksyon mwayèn zewo dansite optik estanda.Konstwi yon koub estanda ak absorbans sou aks vètikal (Y) ak konsantrasyon dsRNA sou aks orizontal (X).

2. Li rekòmande pou fè kalkil la ak lojisyèl òdinatè ki baze sou koub-fitting tankou koub ekspè 1.3 oswa ELISA Calc nan yon modèl 5 oswa 4 paramèt ki pa lineyè.

Pèfòmans

1. Sansiblite:

pi ba limit deteksyon: ≤ 0.001pg/μL (pou UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (pou 5-OMe-UTP-dsRNA).

pi ba limit nan kantite: 0.0156 pg / μL (pou UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg / μL (pou N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg / μL (pou 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV nan Intra-Assay ≤10%, CV nan Inter-Assay ≤10%

3. Recovery: 80% ~ 120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(pou 5-OMe-UTP-dsRNA).

Konsiderasyon

1. Tanperati reyaksyon TMB ak tan se kritik, tanpri kontwole yo dapre enstriksyon an entèdi.

2. Yo nan lòd yo reyalize bon repwodiksyon tès ak sansiblite, bon lave plak yo pou retire depase reyaji ki pa reyaji esansyèl.

3. Tout reyaktif yo ta dwe melanje byen anvan yo itilize epi evite bumbles pandan echantiyon oswa adisyon reyaktif.

4. Si kristal yo te fòme nan tanpon lave konsantre (20x), chofe a 37 ℃ epi melanje dousman jiskaske kristal yo fonn nèt.

5. Evite tès echantiyon ki gen azid sodyòm (NaN3), paske li ka detwi aktivite HRP ki lakòz yon sous-estimasyon kantite dsRNA.

6. Evite kontaminasyon RNase pandan tès la.

7. Estanda/echantiyon an, antikò deteksyon ak SA-HRP ka fèt tou nan RT san yo pa souke, men sa ka lakòz sansiblite deteksyon diminye pa yon sèl-pliye.Pou ka sa a, nou rekòmande estanda UTP ak pUTP dsRNA yo ta dwe dilye soti nan 2pg / μL, estanda N1-Me-pUTP dsRNA yo ta dwe dilye soti nan 4pg / μL ak estanda 5-OMe-UTP dsRNA yo ta dwe dilye soti nan 8pg / μL.Anplis de sa, enkube solisyon k ap travay HRP-streptavidin pou 60min nan tanperati chanm.Pa sèvi ak flacon shaker, paske flask shaker ka lakòz rezilta ki pa kòrèk.

Rezilta tipik

1. Done koub estanda

2. Kalkil koub estanda

3. revètman deteksyon ranje:0.0312- 1pg/μL