mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase te sòti nan yon souch recombinant E. coli ki pote jèn pou vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase la.Anzim sa a ajoute yon gwoup methyl nan pozisyon 2'-O nan premye nukleotid adjasan a estrikti nan bouchon nan fen 5' nan RNA a. -0) sa ki lakòz yon estrikti kap-1.
Estrikti Cap1 ka ogmante efikasite tradiksyon an, amelyore ekspresyon mRNA nan eksperyans transfeksyon ak mikro-enjeksyon. Anzim sa a espesyalman mande pou RNA ak yon bouchon m7GpppN kòm substra.Li pa ka itilize RNA ak pN, ppN, pppN oswa GpppN nan fen 5' la.Yo ka prepare RNA kapped atravè transkripsyon in vitro lè l sèvi avèk analòg bouchon oswa nan bouchon anzimatik lè l sèvi avèk Vaccinia Capping Enzyme.
Eleman
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)
10×Capping Tanpon reyaksyon
Depo
-25 ～- 15 ℃ pou depo （ Evite repete sik friz-dekonjle）
Tanpon depo
20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100， 50% gliserin.
Definisyon inite
Yo defini yon inite kòm kantite anzim ki nesesè pou methylate 10 pmol nan transkripsyon RNA 80 nt bouchon nan 1 èdtan nan 37°C.
Esay kontwòl kalite
Egzonukleaz: 50U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase ak 1μg λ-Hind III dijere ADN nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
Endonukleaz: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ak 1 μg λDNA nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ak 1μg pBR322 nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ak 1.6μg MS2 RNA pou 4 èdtan nan 37 ℃ pa bay okenn degradasyon jan sa detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
E. coli ADN: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase teste pou prezans nanE. coli ADN jenomik lè l sèvi avèk TaqMan qPCR ak primè espesifik pou laE. coli 16S rRNA kote.LaE. coli kontaminasyon ADN jenomik se =1E. coli genòm.
Bakteri Endotoxin: LAL-tès, dapre Chinwa Pharmacopeia IV 2020 edisyon, metòd tès limit jèl, règ jeneral (1143).Kontni endotoxin bakteri yo ta dwe = 10 EU/mg.
Sistèm reyaksyon ak kondisyon yo
1. Konbine yon kantite apwopriye Cappped RNA ak RNase-gratis H2O nan yon tib mikrofuge 1.5 mL nan yon volim final 16.0 µL.
2. Chofe nan 65 ℃ pou 5 minit ki te swiv pa yon beny glas pou 5 minit.
3. Ajoute konpozan sa yo nan lòd espesifye a (pou metilasyon RNA Cappped
mwens pase 10
| Eleman | Volim |
| RNA denatire ki kouvri | 16 μL |
| 10X Tanpon Reyaksyon Limit * | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | Pou 20 μL |
* 10 × Tanpon Reyaksyon Capping: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Enkube nan 37 ℃ pou 1 èdtan (2 èdtan nan enkubasyon rekòmande pou fragman sib la mwens pase 200 nt).
Aplikasyon
Pou amelyore ekspresyon mRNA pandan eksperyans microinjection ak transfection.
Nòt sou itilizasyon
1. Anvan reyaksyon, RNA yo ta dwe pirifye ak fonn nan dlo nuclease-gratis, tout solisyon yo pa ta dwe gen okenn EDTA ak iyon.
2. Li rekòmande pou chofe echantiyon RNA a nan 65 ℃ pou 5 minit anvan reyaksyon an pou retire estrikti segondè a nan fen 5 nan transkripsyon an.Li ta ka pwolonje a 10 min pou estrikti konplèks 5 '-tèminal.
