PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) se metòd anzimatik ki pi efikas pou retire prèske tout oligosakarid N-lye nan glikoprotein.PNGase F se yon amidaz, ki fende ant GlcNAc ki pi anndan yo ak rezidi asparagin nan gwo mannoz, ibrid, ak oligosakarid konplèks ki soti nan glikoprotein N-lye.
Aplikasyon
Anzim sa a itil pou retire rezidi idrat kabòn nan pwoteyin.
Preparasyon ak spesifikasyon
Aparans | Likid san koulè |
Pwoteyin pite | ≥95% (soti nan SDS-PAGE) |
Aktivite | ≥500,000 U/mL |
Egzoglikozidaz | Yo pa ka detekte okenn aktivite (ND) |
Endoglikozidaz F1 | ND |
Endoglikozidaz F2 | ND |
Endoglikozidaz F3 | ND |
Endoglikozidaz H | ND |
Pwoteaz | ND |
Pwopriyete
Nimewo EC | 3.5.1.52(Rekonbine soti nan mikwo-òganis) |
Pwa molekilè | 35 kDa (SDS-PAGE) |
Pwen izoelektrik | 8. 14 |
PH pi bon | 7.0-8.0 |
Tanperati pi gwo | 65 °C |
Espesifik substrate | Fende lyezon glikozidik ant GlcNAc ak rezidi asparagin Fig.1 |
Sit rekonesans | N-lye glycans sof si genyen α1-3 fucose Fig. 2 |
Aktivatè | DTT |
Inibitè | SDS |
Tanperati depo | -25 ~ -15 ℃ |
Inaktivasyon chalè | Yon melanj reyaksyon 20µL ki gen 1µL PNGase F inaktive pa enkubasyon nan 75 °C pou 10 minit. |
Fig. 1 Espesifik substrate PNGase F
Fig. 2 Sit rekonesans PNGase F.
Lè rezidi GlcNAc entèn yo lye ak α1-3 fucose, PNGase F pa ka fennen oligosakarid N-lye soti nan glikoprotein.Modifikasyon sa a komen nan plant ak kèk glikoprotein ensèk.
Copozan
| Eleman | Konsantrasyon |
1 | PNGase F | 50 µl |
2 | 10 × Glycoprotein Denaturating Tanpon | 1000 µl |
3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definisyon inite
Yon inite (U) defini kòm kantite anzim ki nesesè pou retire >95% idrat kabòn nan 10 µg RNase B denatire nan 1 èdtan nan 37 °C nan yon volim reyaksyon total de 10 µL.
Kondisyon reyaksyon yo
1.Fouye 1-20 µg glycoprotein ak dlo deyonize, ajoute 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturating Tanpon ak H2O (si sa nesesè) pou fè yon volim reyaksyon total 10 µl.
2.Enkube nan 100 ° C pou 10 minit, fre li sou glas.
3.Ajoute 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 epi melanje.
4.Ajoute 1-2 µl PNGase F ak H2O (si sa nesesè) pou fè yon volim reyaksyon total 20 µl epi melanje.
5.Enkube reyaksyon a 37 ° C pou 60 min.
6.Pou analiz SDS-PAGE oswa analiz HPLC.