RTL ranvèse transkriptaz
RTL ranvèse transkriptaz se yon ADN polymerase ki depann de modèl RNA ki manke aktivite eksonukleaz 3'→5' epi ki gen aktivite RNase H.Anzim sa a ka sèvi ak RNA kòm yon modèl pou fè sentèz yon fil konplemantè ADN, ki ka aplike nan sentèz premye strand cDNA, espesyalman pou RT-LAMP (anplifikasyon izotèmik ki medyatè).Konpare ak RTL ranvèse transkriptaz 1.0, sansiblite a amelyore anpil, estabilite tèmik la pi fò, ak reyaksyon an nan 65 ° C pi estab.RTL ranvèse transkriptaz (gliserin gratis) ka itilize pou prepare preparasyon lyofilize, reyaktif lyofilize RT-LAMP elatriye.
Definisyon inite
Yon inite enkòpore 1 nmol dTTP nan materyèl asid-presipitab nan 20 minit nan 50 ° C lè l sèvi avèk poly(A)•oligo(dT)25 kòm modèl-primer.
Eleman
| Eleman | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ranvèse transkriptaz (san glisewol) (15U/μL) | 0.1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL tanpon | 1.5 ml | 4 × 1.5 mL | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 ml | 2 × 1.5 mL | 3 × 10 mL |
Kondisyon Depo
Transpò anba 0 ° C epi yo dwe estoke nan -25 ° C ~ -15 ° C.
Kontwol kalite
- Aktivite rezidyèl nanEndonukleaz:Yon reyaksyon 50 μL ki gen 1 μg λDNA ak 15 inite RTL2.0 enkubasyon pou 16 èdtan nan 37 ℃ montre menm modèl ak kontwòl negatif pa elektwoforèz jèl.
- Aktivite rezidyèl nanEgzonukleaz:Yon reyaksyon 50 μL ki gen 1 μg Hind Ⅲ dijere λDNA ak 15 inite RTL2.0 enkubasyon pou 16 èdtan nan 37 ℃ montre menm modèl ak kontwòl negatif pa elektwoforèz jèl.
- Aktivite rezidyèl nanNickase:Yon reyaksyon 50 μL ki gen 1 μg pBR322 supercoiled ak 15 inite RTL2.0 enkubasyon pou 4 èdtan nan 37 ° C montre menm modèl ak kontwòl negatif pa elektwoforèz jèl.
- Aktivite rezidyèl nanRNase:Yon reyaksyon 10 μL ki gen 0.48 μg MS2 RNA ak 15 inite RTL2.0 enkubasyon pou 4 èdtan nan 37 ° C montre menm modèl ak kontwòl negatif pa elektwoforèz jèl.
- E. coli gADN:Mezire akE.colitwous deteksyon HCD espesifik, 15 inite RTL2.0 gen mwens pase 1E. coligenòm.
Enstalasyon reyaksyon
Pwotokòl sentèz cDNA
| Eleman | Volim |
| Modèl RNA a | opsyonèl |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) oswa Melanj Primè o aza (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM chak) | 1 μL |
| Inibitè RNaz (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL ranvèse transkriptaz 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL tanpon | 2 μL |
| Dlo san nukleaz | Jiska 20 μL |
Nòt:
1) Dòz rekòmande total RNA se 1ng ~ 1μg
2) Dòz la rekòmande nan mRNA te 50ng ~ 100ng
Thermo-monte bisiklèt Kondisyon pou yon woutin reyaksyon:
| Tanperati (°C) | Tan |
| 25 °Ca | 5min |
| 55 °C | 10minb |
| 80 °C | 10min |
Nòt:
1) Si yo itilize Random Primer Mix, yon etap enkubasyon nan 25 ° C.
2) Si yo itilize melanj primè sib, yon etap enkubasyon nan 55 ° C pou 10 ~ 30 minit.
Pwotokòl RT-LAMP
| Eleman | Volim | Final Konsantrasyon |
| Modèl RNA | opsyonèl | ≥10 kopi |
| dNTP melanje (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mm |
| Prensip FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inibitè (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reyaksyon |
| RTL ranvèse transkriptaz 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Reyaksyon |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reyaksyon |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 × HC RTL tanpon (oswa 10 × HC Bst V2 tanpon) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Dlo san nukleaz | Jiska 25 μL | - |
Nòt:
1) Melanje pa vortexing epi santrifuje yon ti tan pou kolekte.Enkubasyon tanperati konstan nan 65 ° C pou 1 èdtan.
2) De tanpon yo entèoperab epi yo gen menm konpozisyon.
Nòt
1.Pwodwi sa a pral fòme yon solid blan lè yo estoke nan -20 °C.Retire li nan -20 ° C epi mete l sou glas pou apeprè 10 minit.Apre k ap fonn, li ka itilize pa souke ak melanje.
2.The cDNA pwodwi ta ka estoke nan -20 ° C oswa -80 ° C oswa itilize imedyatman pou reyaksyon PCR.
3.Pou anpeche kontaminasyon RNase, tanpri kenbe zòn eksperimantal la pwòp, epi mete gan pwòp ak mask pandan operasyon an.
