Vaccinia Viris Capping Anzim
Vaccinia viris capping anzim sòti nan yon souch recombinant E. coli ki pote jèn yo pou anzim capping Vaccinia.Se sèl anzim sa a ki konpoze de de subinite (D1 ak D12) e li gen twa aktivite anzimatik (RNA trifosfataz ak guanylyltransferase pa subinite D1 a ak guanine methyltransferase pa subunite D12).Vaccinia viris Capping Anzim efikas pou katalize fòmasyon nan estrikti bouchon, ki ka espesyalman tache estrikti nan bouchon 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) nan fen 5 'nan RNA.Estrikti Cap (Cap 0) jwe yon wòl enpòtan nan estabilizasyon mRNA, transpò ak tradiksyon nan ekaryot.Kapping RNA pa reyaksyon anzimatik se yon metòd efikas ak senp ki ka siyifikativman amelyore estabilite ak tradiksyon RNA pou transkripsyon vitro, transfèksyon, ak mikro-enjeksyon.
Eleman
Vaccinia Viris Capping Anzim (10 U/μL)
10×Capping Tanpon
Kondisyon depo
-25～- 15℃ pou depo （Evite sik repete friz-dekonjle）
Tanpon depo
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliserin.
Definisyon inite
Yon inite Vaccinia viris Capping Enzyme defini kòm kantite anzim ki nesesè pou enkòpore 10pmol GTP nan yon transkripsyon 80nt nan 1 èdtan nan 37°C.
Kontwol kalite
Egzonukleaz:10U nan Vaccinia viris Capping Anzim ak 1μg λ-Hind III dijere ADN nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
Endonukleaz:10U nan Vaccinia viris Capping Anzim ak 1μg λDNA nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
Nickase:10U nan Vaccinia viris Capping Anzim ak 1 μg pBR322 nan 37 ℃ pou 16 èdtan pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
RNase:10U nan Vaccinia viris Capping Anzim ak 1.6μg MS2 RNA pou 4 èdtan nan 37℃ pa bay okenn degradasyon jan yo detèmine pa elektwoforèz jèl agarose.
1.coli ADN:Yo teste 10U nan Vaccinia virus Capping Enzyme pou prezans ADN jenomik E. coli lè l sèvi avèk TaqMan qPCR ak primè espesifik pou E. coli 16S rRNA locus la.Kontaminasyon ADN jenomik E. coli se ≤1 genomic E. coli.
2.Bakteri Endotoxin: LAL-tès, dapre Chinwa Pharmacopoeia IV 2020 edisyon, metòd tès limit jèl, règ jeneral (1143).Kontni endotoxin bakteri yo ta dwe ≤10 EU/mg.
Sistèm reyaksyon ak kondisyon yo
1. Pwotokòl Capping (volim reyaksyon: 20 μL)
Pwosedi sa a aplikab pou reyaksyon capping 10μg RNA (≥100 nt) epi li ka ogmante selon demann eksperimantal.
I) Konbine 10μg RNA ak H2O san nukleaz nan yon tib mikrofuge 1.5 ml nan yon volim final 15.0 μL.*10×Capping Tanpon: 0.5M Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) Chofe nan 65 ℃ pou 5 minit ki te swiv pa yon beny glas pou 5 minit.
3) Ajoute eleman sa yo nan lòd espesifye a
| Copozan | Volume |
| RNA denatire (≤10μg, longè≥100 nt) | 15 μL |
| 10×Cappping Tanpon* | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Vaccinia viris Capping Anzim (10U/μL) | 1 μL |
* 10 × Tapon plafon: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) Enkube nan 37 ° C pou 30 minit, RNA se kounye a kouvri ak pare pou aplikasyon pou en.
2. 5′ tèminal reyaksyon etikèt (volim reyaksyon: 20 μL)
Pwotokòl sa a fèt pou make RNA ki gen yon trifosfat 5' epi li ka ogmante selon demann yo.Efikasite enkòporasyon etikèt la pral afekte pa rapò molè RNA: GTP, osi byen ke kontni GTP nan echantiyon RNA yo.
1) Konbine kantite apwopriye RNA ak H2O san nukleaz nan yon tib mikrofuge 1.5 ml nan yon volim final 14.0 µL.
2) Chofe nan 65 ℃ pou 5 minit ki te swiv pa yon beny glas pou 5 minit.
3) Ajoute eleman sa yo nan lòd ki espesifye.
| Copozan | Volume |
| RNA denatire | 14 μL |
| 10×Capping Tanpon | 2 μL |
| GTP melanj** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Vaccinia viris Capping Anzim (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX refere a GTP ak yon ti kantite makè.Pou konsantrasyon GTP, gadepou nòt 3.
4) Enkube nan 37 ° C pou 30 minit, RNA 5′ fen kounye a make ak pare pou en.
Aplikasyon
1. Limitasyon mRNA anvan tès tradiksyon/tradiksyon in vitro
2. Mete etikèt sou 5' fen mRNA
Nòt sou itilizasyon
1.Chofe solisyon RNA a anvan enkubasyon ak Vaccinia Capping Enzyme retire estrikti segondè nan fen 5 nan transkripsyon an.Pwolonje tan a 60 minit pou relve nòt ak 5'fen li te ye trè estriktire.
2. Yo ta dwe pirifye RNA yo itilize pou kapping reyaksyon yo anvan yo itilize yo epi yo dwe sispann nan dlo san nukleaz.EDTA pa ta dwe prezan epi solisyon an pa ta dwe san sèl.
3. Pou mete etikèt sou fen 5' la, konsantrasyon total GTP a ta dwe anviwon 1-3 fwa konsantrasyon molè mRNA nan reyaksyon an.
4. Volim nan sistèm reyaksyon an ka monte oswa desann selon aktyèl la.
