ADN Ekstraksyon Mini Twous
Twous sa a adopte sistèm tanpon optimize ak teknoloji pirifikasyon kolòn jèl silica, ki ka refè 70 bp - 20 kb fragman ADN nan divès konsantrasyon nan jèl agaroz TAE oswa TBE.Kolòn adsorption ADN ka espesyalman adsorp ADN nan kondisyon ki gen anpil sèl.Anplis de sa, twous la ka dirèkteman pirifye fragman ADN ki soti nan pwodwi PCR, sistèm reyaksyon anzimatik oswa pwodwi ADN brit ki te jwenn pa lòt metòd, epi retire enpurte tankou pwoteyin, lòt konpoze òganik, iyon sèl inòganik ak primè oligonukleotid.Li ka asire ke pirifikasyon an ka fini nan 10-15min.ADN pirifye a ka itilize dirèkteman pou ligasyon, transfòmasyon, dijesyon anzim, transkripsyon in vitro, PCR, sekans, mikro-enjeksyon, elatriye.
Kondisyon depo
Sere nan -15 ~ -25 ℃ epi transpòte nan tanperati chanm.
Eleman
| Eleman | (100 rxns) |
| Tanpon GDP | 80 ml |
| Tanpon GW | 2 × 20 ml |
| Tanpon elisyon | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
GDP tanpon:ADN tanpon obligatwa.
Tanpon GW:Tanpon lave;ajoute etanòl absoli pa volim ki endike sou boutèy la anvan ou itilize.
Tanpon elisyon:Elisyon.
FastPure DNA Mini Columns-G:Kolòn adsorption ADN.
Tib koleksyon 2 ml:Tib koleksyon pou filtraj.
Materyèl Prepare
1.5 ml tib esterilize, etanòl absoli ak izopropanol (lè fragman ADN ≤100 bp, ajoute 1 volim
izopropanol nan 1 volim jèl), beny dlo.
Pwosesis Eksperyans
Ajoute 80 ml etanòl pou dilye Buffer GW jan sa endike sou etikèt la anvan w itilize, estoke nan tanperati chanm.
Mekanis
1. Solisyon reyaksyon PCR
Konplo ekstraksyon jèl: ajoute volim egal tanpon GDP PCR reyaksyon solisyon rekiperasyon konplo:Ajoute 5 fwa tanpon volim lan
2. GDP Kalkile volim jèl (100 μl egal 100 mg)
Fonn jèl
3. Chofe nan 50 ~ 55℃
4. Bind Lave
Ajoute 300 μL GDP tanpon*
Ajoute 700 μL tanpon GW
Ajoute 700 μL tanpon GW
5. Elite
Ajoute 20 - 30μL tanpon elisyon oswa dlo deyonize
Nòt * PCR reyaksyon likid rekiperasyon san etap sa a
Pwogram ekstraksyon jèl
1. Apre elektwoforèz ADN pou fraksyone fragman ADN, retire yon sèl bann fragman ADN ki soti nan jèl agarose anba limyè UV.Li rekòmande pou itilize papye absòbe pou absòbe imidite aparan nan jèl epi minimize gwosè tranch jèl la lè w retire siplemantè agaroz ke ou kapab.Peze tranch jèl la (san tib mikrosantrifij) pou kalkile volim li: Volim 100 mg gelslice se apeprè 100 μL, sipoze dansite a se 1g/ml.
2. Ajoute volim egal tanpon GDP, enkubasyon nan 50 ~ 55 ℃ pou 7-10 min (dapre gwosè jèl la, ajiste tan enkubasyon jiskaske jèl la konplètman fonn).Envèse tib la 2 fwa pandan enkubasyon an.
Δ Ajoute 1-3 volim GDP tanpon pa pral enfliyanse efikasite rekiperasyon ADN.Si yo dwe refè fragman ADN la <100 bp, yo bezwen ajoute 3 volim GDP tanpon;lè tranch jèl la fonn nèt, ajoute 1 volim izopropanol epi melanje byen, epi kontinye nan pwochen etap la.
3. Santrifije yon ti tan pou pote echantiyon an nan pati anba tib la, mete FastPure DNA Mini Columns-G nan Tib Koleksyon 2 ml, ak anpil atansyon transfere solisyon an maksimòm 700 μL yon fwa pa.
tan nan kolòn filtraj yo, santrifuje nan 12,000 rpm (13,800 X g) pou 30-60 sec.
4. Jete filtraj la epi ajoute 300 μL Buffer GDP nan kolòn nan, enkube nan tanperati chanm pou 1 min, santrifije nan 12,000 rpm (13,800 X g) pou 30-60 sec.
5. Jete filtraj la epi ajoute 700 μL Tanpon GW (tcheke si yo te ajoute etanòl absoli davans!) Nan kolòn nan, santrifije nan 12,000 rpm (13,800 X g) pou 30-60 sec.
Δ Tanpri ajoute Buffer GW ozalantou miray kolòn adsorption la, oswa ajoute kouvèti dèyè Buffer GW epi melanje li tèt anba pou 2-3 fwa pou ede konplètman kole sèl la ki adhere nan miray tib la.
6. Repete etap 5.
Δ Flushing ak tanpon GW de fwa ka asire ke sèl la konplètman retire epi elimine enpak la sou eksperyans ki vin apre yo.
7. Jete filtraj la epi santrifize kolòn vid la nan 12,000 rpm (13,800 X g) pou 2 min.
8. Mete kolòn nan nan yon tib mikwosantrifij pwòp 1.5 ml, ajoute 20 - 30 μL Tanpon Elisyon nan sant manbràn kolòn nan, enkube pou 2 minit, epi answit santrifuje a 12,000 rpm (13,800 X g) pou 1 min.Jete kolòn nan, estoke ADN yo jwenn nan -20 .
Δ Transfere supernatant nan etap 8 la nan kolòn nan elite ankò epi prechofe Tanpon Elisyon an a 55 (lè fragman ADN > 3 kb) petèt itil pou ogmante efikasite rekiperasyon an.
Pwogram rekiperasyon pwodwi PCR
Pwotokòl sa a aplikab pou pirifye fragman ADN ki soti nan pwodwi PCR, sistèm reyaksyon anzimatik ak lòt pwodwi ADN brit (ki gen ladan ADN jenetik).Solisyon sa a ka efikasman retire divès nukleotid, primè, dimers Jadendanfan, molekil sèl, anzim ak lòt enpurte.
1. Yon ti tan santrifize pwodwi PCR, solisyon reyaksyon anzimatik, ak lòt pwodwi ADN brit.Estime volim yo ak pipèt epi transfere nan yon tib esterilize 1.5 ml oswa 2 ml.Ajoute ddH2O jiskaske volim nan jiska 100 μL;pandan ke pou ADN jenomik ak gwo konsantrasyon, dilye a 300 μL ak ddH2O pral ede amelyore efikasite rekiperasyon an.
2. Ajoute 5 volim GDP tanpon, melanje byen pa ranvèse oswa vortexing.Si fragman ADN ki enterese > 100 bp, yo bezwen ajoute 1.5 volim adisyonèl (echantiyon + GDP tanpon) etanòl.
3. Mete kolòn nan tounen nan tib koleksyon an, transfere melanj la nan kolòn nan, santrifuje nan 12,000 rpm (13,800 × g) pou 30 - 60 sec.Si volim solisyon melanje a se > 700 µL, mete kolòn adsorption a tounen nan tib koleksyon an, transfere solisyon ki rete a nan kolòn adsorption a, epi santrifije nan 12,000 rpm (13,800 × g) pou 30 - 60 sec.
4. Pèfòmans kap vini an refere a etap 5 – 8 nan pwogram ekstraksyon 08-1/Gel.
Aplikasyon
Divès konsantrasyon nan TAE oswa TBE agarose jèl;Pwodwi PCR, sistèm reyaksyon anzimatik oswa lòt pwodwi ADN brit yo jwenn pa divès metòd.Fragman refè varye ant70 bp -20 kb.
Nòt
Pou rechèch itilize sèlman.Pa pou itilize nan pwosedi dyagnostik.
1. Ajoute 80 ml etanòl pou dilye Buffer GW jan sa endike sou tag anvan ou itilize, sere nan tanperati chanm.
2. Si tanpon GDP a fasil pou presipite pandan depo ba-tanperati, li ka mete nan tanperati chanm pou yon peryòd de tan anvan ou itilize.Si sa nesesè, li ka prechofe nan yon beny dlo 37 ℃ jiskaske presipite a konplètman fonn, epi Lè sa a, li ka itilize apre melanje.
3. Mete tanperati beny dlo a 50 ~ 55 ℃ davans.
4. Nan 08-1/Gel fè ekstraksyon pwogram etap 1, minimize gwosè tranch jèl la pral siyifikativman diminye tan dissolution ak ogmante efikasite rekiperasyon (ADN linearize fasil pou idrolize lè yo toujou ekspoze nan tanperati ki wo).Pa ekspoze jèl ADN nan UV pou yon tan long, paske limyè iltravyolèt ka lakòz domaj ADN.
5. Fonn jèl la nan etap 2 pwogram ekstraksyon 08- 1/Gel nèt, otreman efikasite rekiperasyon ADN pral afekte seryezman.
6. Prechofe tanpon elisyon oswa ddH2O a 55 ℃, ki itil pou amelyore efikasite elisyon ADN.Li rekòmande pou estoke ADN nan eluyan 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5.
