EndoFree Plasmid Maxi Twous

Kondisyon depo

RNaseA ta dwe estoke nan -30 ~ -15 ℃ epi transpòte nan ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger ka estoke nan 2 ~ 8 ℃ pou yon mwa, ki estoke nan -30 ~ -15 ℃ pou depo alontèm.epi transpòte nan ≤0℃.

Lòt konpozan yo ta dwe estoke nan tanperati chanm (15 ~ 25 ℃) epi transpòte nan tanperati chanm.

Eleman

RNaseA:10 mg/ml, yo itilize pou retire RNA.

Tanpon P1:tanpon sispansyon bakteri, ajoute RNaseA nan tanpon P1 anvan premye itilize.

Tanpon P2:tanpon liz bakteri (ki gen SDS/NaOH).

Tanpon P4:netralize tanpon.

Endotoxin Scavenger:efektivman retire endotoxin soti nan ekstrè nan plasmid brit.

Tanpon PW:lave tanpon, ajoute volim nan etanòl anvan premye itilize.

Tanpon TB:tanpon elisyon.

FastPure DNA Maxi Kolòn:kolòn adsorption ADN plasmid.

Tib koleksyon 50 ml:tib koleksyon filtrate.

Tib koleksyon san endotoksin:tib koleksyon ADN plasmid.

Materyèl Prepare

Etanòl absoli, izopropanol, 50 ml tib santrifijeur wonn ak 50 ml san endotoksin.tib santrifujeur.

Aplikasyon

Pwodui sa a apwopriye pou fè ekstraksyon nan gwo echèl plasmid soti nan 150 - 300 ml solisyon bakteri.kiltive lannwit lan.

Pwosesis Eksperyans

1. Pran 150 - 200 ml (pa plis pase 300 ml) solisyon bakteri kiltive lannwit lan epi santrifije nanapeprè 11,000 rpm (12,000 × g) pou 1 - 2 min.Jete supernatant la epi kolekte bakteri.

Δ Lè yo kolekte plis pase 50 ml solisyon bakteri, yo ka kolekte bakteri yo lè yo ajoute solisyon bakteri, santrifujasyon, jete supernatant la ak lòt etap nan menm tib 50 ml pou

plizyè fwa.

2. Ajoute 7.5 ml tanpon P1 (tanpri tcheke si RNaseA te ajoute nan tanpon P1) nan santrifijeur la.tib ki gen bakteri ak melanje byen pa vortex oswa pipette.

Δ Resuspension konplè bakteri nan etap sa a enpòtan anpil pou bay, epi pa ta dwe gen okenn boul bakteri apre resuspension.Si gen boul bakteri ki pa byen melanje, li pral afekte lysis la, sa ki lakòz pwodiksyon ba ak pite.Si OD600 nan solisyon bakteri se 0.65, li rekòmande pou itilize 7.5 ml tanpon P1 lè èkstraksyon soti nan 150 ml solisyon bakteri;lè OD600 se 0.75, yo ta dwe itilize 8 ml Tanpon P1 ak volim Tanpon P2 ak P4 yo ta dwe chanje kòmsadwa.Si volim nan solisyon bakteri an ogmante a 200 ml, li rekòmande ke lavolim Tanpon P1, P2, ak P4 dwe ogmante pwopòsyonèlman.

3. Ajoute 7.5 ml Tanpon P2 nan sispansyon bakteri an soti nan etap 2 epi melanje dousman leve, desann pou 6 - 8.fwa epi enkube nan tanperati chanm pou 4-5 min.

Δ Envèse dousman pou melanje byen.Vortexing pral lakòz fwagmantasyon ADN jenomik la, sa ki lakòz fragman ADN jenomik nan plasmid la ekstrè.Nan moman sa a, solisyon an vin gluan ak translusid, ki montre ke bakteri yo te konplètman lysed.Dire a pa ta dwe depase 5 minit pou evite destriksyon plasmid yo.Si solisyon an pa klè, ka gen twòp bakteri ki lakòzliz enkonplè, kidonk kantite bakteri yo ta dwe redwi kòmsadwa.

4. Ajoute 7.5 ml Tanpon P4 nan sispansyon bakteri an nan etap 3 a epi imedyatman ranvèse dousman 6 – 8 fwa pou pèmèt solisyon an netralize Tanpon P2 nèt.Nan moman sa a, presipite flokulan blan ta dwe parèt.Santrifije nan plis pase apeprè 11,000 rpm (12,000 × g) pou 10-15 min, ak anpil atansyon pipete supernatant la nan yon nouvo tib santrifij 50 ml wonn-an (oto-prepare), epi evite.aspire presipite blan k ap flote a.

Δ Ajoute tanpon P4 epi imedyatman ranvèse pou melanje byen.Kite tib la kanpe jiskaske presipitasyon blan an distribye respire nan tout solisyon an pou anpeche pwodiksyon presipitasyon lokal la ki ta ka afekte netralizasyon.Si pa gen okenn presipite flokulan blan inifòm anvan santrifujasyon ak supernatant la pa klè apre santrifujasyon, tib la kasantrifuje pou yon lòt 5 minit.

5. Ajoute 0. 1 fwa volim (10% volim supernatant, apeprè 2.2 ml) Endotoxin Scavenger nan supernatant ki soti nan etap 4 la epi ranvèse pou melanje.Mete solisyon an nan yon beny glas oswa mete l nan glas kraze (oswa frijidè frijidè) pou 5 minit jiskaske solisyon an chanje soti nan twoub a klè ak transparan (oswa toujou.yon ti kras twoub), epi detanzantan melanje plizyè fwa.

Δ Apre yo fin ajoute Endotoxin Scavenger a nan supernatant la, supernatant la ap vin twoub mensupernatant ta dwe vin klè (oswa yon ti kras twoub) apre refwadisman nan beny glas la.

6. Apre yo fin mete supernatant la nan tanperati chanm (>25℃) pou 10-15 min, li pral vin twoub kòmtanperati li ogmante nan tanperati chanm.Lè sa a, supernatant la ta dwe ranvèse pou melanje.

Δ Si tanperati chanm nan pi ba oswa ou vle diminye tan ekstraksyon, yo ka enkube supernatant la nan yon beny dlo 37 ~ 42 ℃ pou 5 - 10 minit epi pwochen etap la ka fèt apre supernatant la.vin twoub.

7. Santrifize supernatant la nan apeprè 11,000 rpm (12,000 × g) pou 10 min nan tanperati chanm (tanperati a dwe > 25 ℃) pou separe faz la.Faz akeuz anwo a gen ADN la pandan y ap pi ba kouch faz lwil ble a gen endotoksin ak lòt enpurte.Transfere laADN ki gen faz akeuz nan yon nouvo tib akjete kouch lwil la.

Δ Tanperati a pandan santrifujasyon dwe plis pase 25 ℃ kòm separasyon faz efikas pa fè sarive si tanperati a twò ba.

Δ Si separasyon faz la pa efikas, tanperati santrifujasyon an ka ajiste a 30 ℃ aktan santrifujasyon an ka ogmante a 15 min.

Δ Pa souse kouch lwil ble a paske li gen endotoksin ak lòt enpurte.

Mekanis

Resuspension Lysis netralizasyon

◇ Ajoute 7.5 ml Tanpon P1

◇ Ajoute 7.5 ml Tanpon P2

◇ Ajoute 7.5 ml Tanpon P4

Endotoxin retire

◇Ajoute 0. 1 fwa volim supernatant Endotoxin Scavenger

Liaison ak lave

◇ Ajoute 0.5 fwa volim isopropanol

◇ Ajoute 10 ml Tanpon PW