Plant dirèk PCR Twous

No chat: HCR2020A

Plant Direct PCR Twous apwopriye pou anplifikasyon dirèk nan fèy plant yo, grenn, elatriye, epi li ka itilize pou tès depistaj segondè-debi echantiyon plant ki pa gen polisakarid ak polifenol.Anplifikasyon dirèk ADN polymerase ki baze sou evolisyon dirije a gen yon tolerans siperyè pou inhibiteurs PCR nan plant yo.Pandan se tan, li kenbe pèfòmans nan anplifikasyon segondè, ki se apwopriye pou anplifikasyon nan fragman ADN nan 5 kb.Liz tanpon inik A nan twous la ka itilize pou lise tisi plant fre oswa nan frizè.Li fasil pou opere epi lisat la ka itilize kòm yon modèl pou anplifikasyon san yo pa pirifye.Sistèm nan gen ajan pwoteksyon ki pèmèt echantiyon brit yo dwe efektivman anplifye apre konjelasyon repete ak dekonjle.2 × Plant Direct Master Mix sèlman bezwen ajoute primè ak modèl pou fè reyaksyon anplifikasyon, kidonk diminye operasyon pipetage ak amelyore debi deteksyon ak repwodiksyon rezilta yo.

Eleman

*Plant Direct Lysis Tanpon B se yon reyaktif opsyonèl, ki itilize pou netralize Plant Direct Lysis Tanpon A pou pwolonje tan depo echantiyon yo.Li ka itilize selon sitiyasyon aktyèl la.

Kondisyon Depo

2 × Plant Direct Master Mix, estoke nan -30 ~ -15 ℃ epi evite repete konjelasyon ak dekonjle;Plant Direct Lysis Tanpon, magazen nan -30 ~ -15 ℃ oswa 2 ~ 8 ℃.

Pwosesis Eksperyans

Pwosesis echantiyon–Fèy Plant

Metòd dirèk:Li rekòmande yo sèvi ak fèy jèn.Sèvi ak yon kout pyen twou ak yon dyamèt fiks de 0.5 - 3 mm pou jwenn yon echantiyon ti ak inifòm, ak Lè sa a, dirèkteman ajoute echantiyon an nan sistèm nan PCR (50 μl sistèm rekòmande).Remake byen, asire w ke echantiyon an se nan solisyon an PCR epi li pa kont miray la tib.Si PCR dirèk yo itilize pou anplifye fragman long ak echantiyon konplèks, lè l sèvi avèk yon echantiyon ki gen yon dyamèt ki pi piti (0.5 - 1 mm) kòm yon modèl ka ede jwenn pi bon rezilta.

Metòd liz fanm k'ap pile:Li rekòmande yo sèvi ak fèy jèn.Pran yon ti moso fèy (apeprè 1 - 3 mm an dyamèt), mete l nan 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, epi moulen li otank posib (yo ka fè etap sa a pa peze fèy la ak yon pwent pipèt 100 μl. pou kraze echantiyon an).Si yo itilize pi gwo volim tisi fèy (pa depase 7 mm), ogmante volim tanpon dilution a 50 μl.Apre fèy yo fini, solisyon an ta dwe parèt vèt.Apre yon santrifujasyon tou kout, ajoute 1 μl supernatant nan sistèm PCR la kòm yon modèl reyaksyon.

Metòd liz tèmik:Li rekòmande yo sèvi ak fèy jèn.Pran yon ti moso fèy (apeprè 1 - 3 mm an dyamèt), mete l nan 20 μl Plant Direct Lysis Tanpon A, epi chofe l nan 95 ° C pou 5 - 10 min.Tan liz la ka pwolonje yon fason apwopriye pou fèy ki difisil pou liz (pa plis pase 20 min).Si yo itilize pi gwo volim tisi fèy (pa depase 7 mm), ogmante volim tanpon dilution a 50 μl.Apre chofaj, santrifuje yon ti tan, epi ajoute 1 μl supernatant nan sistèm PCR la kòm yon modèl reyaksyon.

Pwosesis echantiyon-Plante Grenn

Metòd liz fanm k'ap pile:Sèvi ak yon bistouri pou koupe grenn ki gen yon dyamèt 5 mm, ajoute yo nan 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, epi moulen echantiyon an ak yon pwent pipèt oswa lòt zouti.Vortex yon ti tan epi kite kanpe nan tanperati chanm pou 3-5 minit.Asire w ke echantiyon grenn nan submerged nan tanpon dilution la.Apre yon santrifujasyon tou kout, ajoute 1 μl supernatant nan sistèm PCR la kòm yon modèl reyaksyon.

Metòd liz tèmik:Sèvi ak yon bistouri pou koupe grenn ki gen yon dyamèt 5 mm, ajoute yo nan 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, epi chofe a 95 ° C pou 5 - 10 min.Tan liz la ka pwolonje yon fason apwopriye pou fèy ki difisil pou liz (pa plis pase 30 minit).Apre chofaj, santrifuje yon ti tan, epi ajoute 1 μl supernatant nan sistèm PCR la kòm yon modèl reyaksyon.

a.Yo ka itilize sizo oswa lòt zouti tou pou koupe echantiyon gwosè apwopriye;si kout pwen an oswa sizo yo reitilize, yo ta dwe netwaye ak 2% solisyon ipoklorit sodyòm anvan chak itilizasyon pou anpeche kwa-kontaminasyon ant echantiyon yo.

b.Asire w ke Plant Direct Lysis Tanpon an konplètman fonn anvan ou itilize.Si tanpon an gluan oswa gen presipite, li ka chofe a 37 ℃ pou fonn li nèt anvan ou itilize.

c.Volim nan modèl nan sistèm reyaksyon an ka ajiste yon fason ki apwopriye selon diferans lan nan volim nan materyèl plant ak diluan te ajoute.

Plant Dirèk Liz Tanpon

Plant Direct Lysis Tanpon A ki genyen nan pwodui sa a te estrikteman optimize pou libere genomic pifò tisi plant yo epi li apwopriye pou depo kout tèm plant brit nan 4℃.Si echantiyon an bezwen estoke pou yon peryòd tan ki pi long (egzanp, 1 - 2 mwa), li rekòmande pou transfere supernatant la nan yon nouvo tib EP epi estoke li nan -20 ℃.Pou estoke echantiyon yo pi estab, ajoute yon volim egal nan Plant Direct Lysis Buffer B nan sipènatan transfere a, melanje byen epi estoke nan -20 ℃.Tan depo ki estab varye ak echantiyon plant ak eta yo.

Sistèm reyaksyon

a.Li gen ladan Mg²⁺nan yon konsantrasyon final nan 2 mM.

b.Li rekòmande pou itilize yon konsantrasyon final 0.4μM pou chak jadendanfan.Twòp itilizasyon primè ap mennen nan ogmante anplifikasyon ki pa espesifik.

c.Kantite echantiyon yo itilize ka ajiste selon sitiyasyon aktyèl la.Kantite lajan an itilize nan yon sèl reyaksyon nan echantiyon lysed brit ka ajiste ant 2% - 20% nan volim total reyaksyon an.Sèvi ak echantiyon twòp ka lakòz echèk anplifikasyon.

Pwogram reyaksyon

a.Denaturasyon inisyal (98 ℃, 5 min) ankouraje liz tisi plant yo, lage ADN jenomik ki ka itilize pou anplifikasyon PCR.Pa diminye tan an oswa diminye tanperati a.

b.Li rekòmande pou mete li egal a valè Tm nan jadendanfan oswa 2 ~ 4℃ pi wo pase valè Tm.Anplifikasyon dirèk DNA polymerase yo itilize nan pwodui sa a diferan de konvansyonèl Taq DNA polymerase, e li gen kondisyon espesyal pou tanperati rkwit reyaksyon an; itilizasyon tanperati rkwit segondè ka efektivman redwi anplifikasyon ki pa espesifik ak amelyore efikasite anplifikasyon an.Pou modèl konplèks, anplifikasyon efikas la ka reyalize pa ajiste tanperati rkwit ak pwolonje tan ekstansyon.

c.Si longè pwodwi anplifikasyon an se ≤1 kb, tan ekstansyon an fikse nan 30 sec/kb;si longè pwodwi anplifikasyon an > 1 kb, tan ekstansyon an fikse nan 60 sec/kb.

d.Pou echantiyon konplèks oswa echantiyon ki gen pwodiksyon anplifikasyon ki ba, kantite sik yo ka ogmante kòmsadwa a 40 -50 sik.

Aplikasyon

Li aplikab pou anplifikasyon dirèk nan tisi plant yo ak tès depistaj segondè-debi echantiyon plant ki pa gen polisakarid ak polifenol.

Nòt

Pou rechèch itilize sèlman.Pa pou itilize nan pwosedi dyagnostik.

1. Pou anplifikasyon plant brit oswa anplifikasyon dirèk, li rekòmande pou itilize ADN jenomik pirifye kòm yon kontwòl pozitif anvan yo kòmanse eksperyans la pou asire ke sistèm lan, primè ak operasyon yo kòrèk.

2. Anplifikasyon dirèk DNA polymerase yo itilize nan twous sa a gen gwo aktivite koreksyon.Si yo ta dwe fè klonaj TA, li rekòmande pou pirifye ADN la anvan ou ajoute adenin la.

3. Prensipal Konsèy Konsepsyon:

a.Li rekòmande ke dènye baz la nan fen 3′ nan Jadendanfan an ta dwe G oswa C.

b.Dezakò konsekitif yo ta dwe evite nan dènye 8 baz yo nan fen 3′ nan Jadendanfan an.c.Evite estrikti epengl nan fen 3′ nan Jadendanfan an.

d.Diferans nan valè Tm nan Jadendanfan an pi devan ak Jadendanfan ranvèse a pa ta dwe plis pase 1 ℃ epi yo ta dwe ajiste valè Tm a nan 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 rekòmande pou kalkile valè Tm).

e.Siplemantè sekans primè adisyonèl ki pa matche ak modèl la, pa ta dwe enkli lè w ap kalkile valè primè Tm la.

f.Li rekòmande ke kontni an GC nan Jadendanfan an dwe 40% -60%.

g.Distribisyon an jeneral nan A, G, C ak T nan Jadendanfan an ta dwe menm jan posib.Evite sèvi ak rejyon ki gen gwo kontni GC oswa AT.

h.Evite prezans sekans konplemantè 5 oswa plis baz swa nan primè a oswa ant de primè epi evite prezans sekans konplemantè 3 oswa plis baz nan fen 3′ de primè.

mwen.Sèvi ak fonksyon NCBI BLAST pou tcheke spesifik Jadendanfan an pou anpeche anplifikasyon ki pa espesifik.