Proteinaz K mNGS (likid)
Proteinase K se yon proteaz serin ki estab ak espesifik substra laj.Li degrade anpil pwoteyin nan eta natif natal la menm nan prezans detèjan.Prèv ki soti nan etid kristal ak estrikti molekilè endike anzim nan fè pati fanmi subtilisin ak yon sit aktif triyad katalitik (Asp39-Li69-Sèr224).Sit prensipal klivaj la se kosyon peptide adjasan a gwoup carboxyl asid amine alifatik ak aromat ak gwoup alfa amine bloke.Li se souvan itilize pou spesifik laj li yo.Proteaz K sa a fèt espesyalman pou mNGS.Konpare ak lòt proteinaz K a, li gen menm mwens kontaminasyon asid nikleyè ak menm pèfòmans anzimatik, ki ta ka pi byen asire aplikasyon mNGS en.
Kondisyon Depo
2-8 ℃ pou 2 zan
Spesifikasyon
| Aparans | Likid san koulè a limyè mawon |
| Aktivite | ≥800 U/ml |
| Konsantrasyon Pwoteyin | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Okenn detekte |
| DNase | Okenn detekte |
| RNase | Okenn detekte |
Pwopriyete
| Nimewo EC | 3.4.21.64(Rekonbine nan album Tritirachium) |
| Pwen izoelektrik | 7.81 |
| PH pi bon | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Tanperati pi gwo | 65 ℃ Fig. 2 |
| Estabilite pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Estabilite tèmik | Anba 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Depo estabilite | Plis pase 90% aktivite pou 12 mwa a 25 ℃ |
| Aktivatè | SDS, ure |
| Inibitè | Diisopropyl fluorofosfat;fliyò fenilmetilsulfonil |
Aplikasyon
1. Twous dyagnostik jenetik
2. Twous ekstraksyon RNA ak ADN
3. Ekstraksyon eleman ki pa pwoteyin nan tisi, degradasyon enpurte pwoteyin, tankou ADNvaksen ak preparasyon eparin
4. Preparasyon ADN kwomozòm pa elektwoforèz enpulsyonèl
5. Western blot
6. Enzymatique glycosylated albumin réactifs nan vitro diagnostic
Prekosyon
Mete gan pwoteksyon ak gwo linèt lè w ap itilize oswa peze, epi kenbe byen vantile apre w fin itilize.Pwodui sa a ka lakòz reyaksyon alèjik po ak iritasyon je grav.Si yo respire, li ka lakòz alèji oswa sentòm opresyon oswa dispne.Ka lakòz iritasyon respiratwa.
Definisyon inite
Yon inite (U) defini kòm kantite anzim ki nesesè pou idrolize kazein pou pwodui 1 μmol.tirozin pou chak minit nan kondisyon sa yo.
Preparasyon reyaktif
Reyaktif I: 1g kazein lèt te fonn nan 50ml solisyon 0.1M fosfat sodyòm (pH 8.0), enkubasyon nan 65-70 ℃ dlo pou 15 minit, brase ak fonn, refwadi pa dlo, ajiste pa idroksid sodyòm nan pH 8.0, ak volim fiks. 100ml.
Reyaktif II: 0.1M trichloroacetic asid, 0.2M sodyòm acetate, 0.3M asid acetic.
Reyaktif III: 0.4M Na2CO3solisyon.
Reyaktif IV: reyaktif Forint dilye ak dlo pi pou 5 fwa.
Reyaktif V: diluan anzim: 0.1M solisyon fosfat sodyòm (pH 8.0).
Reyaktif VI: solisyon tirozin: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tirozin fonn ak 0.2M HCl.
Pwosedi
1. 0.5ml reyaktif I pre-chofe a 37 ℃, ajoute 0.5ml solisyon anzim, melanje byen, epi enkube nan37 ℃ pou 10 minit.
2. Ajoute 1ml reyaktif II pou sispann reyaksyon an, melanje byen epi kontinye enkubasyon pou 30 minit.
3. Santrifize solisyon reyaksyon.
4. Pran 0.5ml supernatant, ajoute 2.5ml reyaktif III, 0.5ml reyaktif IV, melanje byen epi enkube nan 37 ℃pou 30min.
5. OD660te detèmine kòm OD1;Gwoup kontwòl vid: 0.5ml reyaktif V yo itilize pou ranplase anzimsolisyon pou detèmine OD660kòm OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozin koub estanda: 0.5mL diferan konsantrasyon L-tirozin solisyon, 2.5mL Reaktif III, 0.5mL Reyaktif IV nan tib santrifij 5mL, enkube nan 37℃ pou 30min, detekte pou OD660pou diferan konsantrasyon L-tirozin, Lè sa a, jwenn koub estanda Y = kX + b, kote Y se konsantrasyon L-tirozin, X se OD.600.
Kalkil
2: Volim total solisyon reyaksyon (mL)
0.5: Volim solisyon anzim (mL)
0.5: Volim likid reyaksyon yo itilize nan detèminasyon kwomojèn (mL)
10: Tan reyaksyon (min)
Df: Dilution miltip
C: Konsantrasyon anzim (mg/mL)
Referans
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komin.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Lajan ewo.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Klonaj molekilè: yon manyèl laboratwa, 2yèm edisyon, Cold Spring HarborLaboratwa Press, Cold Spring Harbor (1989).
Chif
Fig.1 Optim pH
100mM solisyon tanpon: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konsantrasyon anzim: 1mg/mL
Fig.2 Tanperati pi bon
Reyaksyon nan 20 mM K-fosfat tanpon pH 8.0.Konsantrasyon anzim: 1 mg/mL
Fig.3 pH Estabilite
25 ℃, 16 h-tretman ak 50 mM solisyon tanpon: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Konsantrasyon anzim: 1 mg/mL
Fig.4 tèmik estabilite
30 min-tretman ak 50 mM Tris-HCl tanpon, pH 8.0.Konsantrasyon anzim: 1 mg/mL
Fig.5 Depo stabty at 25℃
