M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase se yon transkriptaz ranvèse ki te jwenn nan tès depistaj mitasyon jèn M-MLV ki gen orijin viris lesemi murin Moloney ak ekspresyon nan E.coli.Anzim nan retire aktivite RNase H, gen pi wo tolerans tanperati, epi li apwopriye pou transcription ranvèse wo-tanperati.Se poutèt sa, li itil pou elimine efè favorab nan estrikti wo nivo RNA ak faktè ki pa espesifik sou sentèz cDNA, e li gen pi wo estabilite ak kapasite sentèz transkripsyon ranvèse.Anzim nan gen pi wo estabilite ak ranvèse transcription kapasite sentèz.
Eleman
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand tanpon (si ou vle)
* 5 × First-Strand Buffer pa genyen dNTP, tanpri ajoute dNTP lè w ap prepare sistèm reyaksyon an.
Aplikasyon Rekòmande
1.qRT-PCR yon sèl etap.
2.Deteksyon viris RNA.
Kondisyon Depo
-20 ° C pou depo alontèm, yo ta dwe melanje byen anvan ou itilize, evite souvan friz-degel.
Definisyon inite
Yon inite enkòpore 1 nmol dTTP nan 10 minit nan 37 ° C lè l sèvi avèk poly(A)•oligo(dT)25kòm modèl / premye.
Kontwol kalite
1.SDS-PAGE elektwoforetik pite pi gran pase 98%.
2.Sansiblite anplifikasyon, kontwòl pakèt-a-pakèt, estabilite.
3.Pa gen aktivite nukleaz ekzojèn, pa gen endonukleaz ekzojèn oswa kontaminasyon eksonukleaz
Enstalasyon reyaksyon pou premye solisyon reyaksyon chèn
1.Preparasyon melanj reyaksyon an
| Eleman | Volim |
| Oligo (dT)12-18 Jadendanfan oswa Primè o azaa Oswa Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Modèl RNA | Total RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-gratis dH2O | Pou 10 μL |
Nòt:a/b: Tanpri chwazi diferan kalite primè selon bezwen eksperimantal ou yo.
2.Chofe a 65 ° C pou 5 minit epi refwadi rapidman sou glas pou 2 minit.
3.Ajoute eleman sa yo nan sistèm ki anwo a nan yon volim total de 20µL epi melanje dousman:
| Eleman | Volim (μL) |
| 5 × Premye-Strand tanpon | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inibitè RNase (40 U / μL) | 1 |
| RNase-gratis dH2O | Pou 20 μL |
4. Tanpri fè reyaksyon an selon kondisyon sa yo:
(1) Si yo itilize Random Primer, reyaksyon an ta dwe fèt nan 25 ℃ pou 10 minit, ak Lè sa a, nan 50 ℃ pou 30 ~ 60 minit;
(2) Si yo itilize Oligo dT oswa primè espesifik, reyaksyon an ta dwe fèt nan 50 ℃ pou 30 ~ 60 minit.
5.Chofe a 95 ℃ pou 5 minit pou inaktive Neoscript Reverse Transcriptase epi mete fen nan reyaksyon an.
6.Pwodwi transkripsyon ranvèse yo ka itilize dirèkteman nan reyaksyon PCR ak reyaksyon PCR quantitative fluoresans, oswa estoke nan -20 ℃ pou yon tan long.
PCR Rreyaksyon:
1.Preparasyon melanj reyaksyon an
| Eleman | Konsantrasyon |
| 10 × PCR tanpon (dNTP gratis, Mg²+ gratis) | 1× |
| dNTPs (10mM chak dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mm |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Modèla | ≤10% solisyon premye reyaksyon chèn (2 μL) |
| ddH2O | Pou 50 μL |
Nòt:a: Si yo ajoute twòp solisyon premye reyaksyon chèn, reyaksyon PCR la ka anpeche.
2.Pwosedi reyaksyon PCR
| Etap | Tanperati | Tan | Sik |
| Pre-denaturasyon | 95℃ | 2-5 minit | 1 |
| Denaturasyon | 95℃ | 10-20 sec | 30-40 |
| Recuit | 50-60 ℃ | 10-30 sec | |
| Ekstansyon | 72℃ | 10-60 sec |
Nòt
1.Apwopriye pou optimize tanperati transkripsyon ranvèse nan yon seri 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Li gen pi bon estabilite, se apwopriye pou anplifikasyon transcription ranvèse tanperati ki wo.Anplis de sa, li favorab pou pase avèk efikasite nan rejyon estriktirèl konplèks nan RNA.Epitou, lise apwopriye pou yon sèl-etap multiplex fluoresans quantitative RT-PCR deteksyon.
3.Bon konpatibilite ak divès kalite anzim anplifikasyon PCR epi li apwopriye pou reyaksyon RT-PCR sansiblite segondè.
4.Apwopriye pou gwo sansiblite yon sèl etap fluoresans quantitative RT-PCR reyaksyon, efektivman amelyore pousantaj deteksyon nan konsantrasyon ki ba nan modèl.
5.Apwopriye pou konstriksyon bibliyotèk cDNA.
