Proteinase K NGS (poud)
Non chat: HC4507A
NGS Protease K se yon proteaz serin ki estab ak aktivite anzim segondè ak espesifik substra lajè. Anzim la dekonpoze preferans lyezon ester ak lyezon peptide adjasan a C-terminal asid amine idrofob, asid amine ki gen souf ak asid amine aromat.Se konsa, li se souvan itilize degrade pwoteyin nan peptides kout.NGS Protease K se yon tipik serine proteaz ak Asp la39-Li69-Sèr224Triyad katalitik ki inik nan serin proteaz, epi sant katalitik la antoure pa tow Ca2+sit obligatwa pou estabilizasyon, kenbe aktivite anzim segondè nan yon seri pi laj nan kondisyon yo.
Spesifikasyon
| Aparans | Poud amorphe blan ak blan, lyofilize |
| Aktivite espesifik | ≥40U/mg solid |
| DNase | Okenn detekte |
| RNase | Okenn detekte |
| Biochay | ≤50CFU/g solid |
| Rezid asid nikleik | <5pg/mg solid |
Pwopriyete
| Sous | Tritirachium album |
| Nimewo EC | 3.4.21.64(Rekonbine nan album Tritirachium) |
| Pwa molekilè | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Pwen izoelektrik | 7.81 Fig.1 |
| PH pi bon | 7.0-12.0 (Tout fè gwo aktivite) Fig.2 |
| Tanperati pi gwo | 65℃ Fig.3 |
| Estabilite pH | pH 4.5-12.5 (25 ℃, 16h) Fig.4 |
| Estabilite tèmik | Anba 50 ℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Depo estabilite | Ki estoke nan 25 ℃ pou 12 mwa Fig.6 |
| Aktivatè | SDS, ure |
| Inibitè | Diisopropyl fluorofosfat;benzylsulfonyl fliyò |
Kondisyon Depo
Sere poud lyofilize a nan -25 ~ -15 ℃ pou yon tan long lwen limyè;Apre yap divòse, aliquot nan volim apwopriye pou depo kout tèm nan 2-8 ℃ lwen limyè oswa alontèm depo nan -25 ~ -15 ℃ lwen limyè.
Prekosyon
Mete gan pwoteksyon ak gwo linèt lè w ap itilize oswa peze, epi kenbe byen vantile apre w fin itilize.Pwodui sa a ka lakòz reyaksyon alèjik po ak iritasyon je grav.Si yo respire, li ka lakòz alèji oswa sentòm opresyon oswa dispne.Ka lakòz iritasyon respiratwa.
Definisyon inite
Yon inite NGS Protease K defini kòm kantite anzim ki nesesè pou idrolize kazein nan 1 μmol L-tirozin nan kondisyon detèminasyon estanda.
Preparasyon reyaktif
| Reyaktif | Manifakti | Katalòg |
| Kazein tekniksoti nan lèt bèf | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 20040618 |
| Trichloroacetic asid | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 80132618 |
| Acetate sodyòm | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 10018818 |
| Asid Acetic | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 10011018 |
| Sodyòm carbonate | Sinopharm ChimikRéactif co, Ltd. | 10019260 |
| Foline-fenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co, Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
Reyaktif I:
Substra: 1% kazein soti nan solisyon lèt bèf: fonn 1g kazein lèt bovine nan 50ml nan 0.1M solisyon fosfat sodyòm, pH 8.0, chalè nan beny dlo nan 65-70 °C pou 15mins, brase ak fonn, fre ak dlo, ajiste pa idroksid sodyòm nan pH 8.0, epi delye nan 100ml.
Reyaktif II:
Solisyon TCA: 0.1M trichloroacetic asid, 0.2M sodyòm acetate ak 0.3M asid acetic (peze 1.64g trichloroacetic asid + 1.64g sodyòm acetate + 1.724mL asid acetic successivement, ajoute 50mL dlo deyonize, epi ajiste ak pH 4 nan HC03. 100ml).
Reyaktif III:
0.4m kabonat sodyòm solisyon (peze 4.24g kabonat sodyòm anidrid epi fonn nan 100mL dlo)
Reyaktif IV:
Folin phenol reyaktif: delye 5 fwa ak dlo deyonize.
Reyaktif V:
Diluan anzim: 0.1 M solisyon fosfat sodyòm, pH 8.0.
Reyaktif VI:
L-tirozin solisyon estanda: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tirozin fonn ak 0.2M HCl.
Pwosedi
1. Limen UV-Vis spectrophotometer la epi chwazi mezi fotometrik.
2. Mete longèdonn lan kòm 660nm.
3. Limen beny dlo a, mete tanperati a sou 37 ℃, asire tanperati a pa chanje pou 3-5 minit.
4. Chofe 0.5mL substrate nan yon tib santrifujeur 2mL nan beny dlo 37℃ pou 10min.
5. Ekstrè 0.5mL solisyon anzim dilye nan tib santrifujeur prechofe a pou 10 minit.Mete diluan anzim kòm gwoup vid.
6. Ajoute 1.0 mL reyaktif TCA imedyatman apre reyaksyon an.Melanje byen epi enkube nan beny dlo pou 30 minit.
7. Santrifize solisyon reyaksyon.
8. Ajoute eleman sa yo nan lòd ki espesifye.
| Reyaktif | Volim |
| Supernatant | 0.5 ml |
| 0.4M kabonat sodyòm | 2.5 ml |
| Folin phenol reyaktif | 0.5 ml |
9. Melanje byen anvan enkubasyon nan beny dlo a 37 ℃ pou 30 minit.
10. OD660te detèmine kòm OD1;Gwoup kontwòl vid: Yo itilize diluan anzim pou ranplase solisyon anzim pou detèmine OD660kòm OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirozin koub estanda: 0.5mL diferan konsantrasyon L-tirozin solisyon, 2.5mL 0.4M kabonat sodyòm, 0.5mL Folin fenol reyaktif nan tib santrifij 5mL, enkubasyon nan 37℃ pou 30min, detekte pou OD660pou diferan konsantrasyon L-tirozin, Lè sa a, jwenn koub estanda Y = kX + b, kote Y se konsantrasyon L-tirozin, X se OD600.
Kalkil
2: Volim total solisyon reyaksyon (mL)
0.5: Volim solisyon anzim (mL)
0.5: Volim likid reyaksyon yo itilize nan detèminasyon kwomojèn (mL)
10: Tan reyaksyon (min)
Df: Dilution miltip
C: Konsantrasyon anzim (mg/mL)
Chif
Fig.1 rezidi ADN
| Egzanp | Ave C4 | Asid nikleik Rekiperasyon (pg/mg) | Rekiperasyon (%) | Total Nikleik Asid ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-gratis H2O | Endetèmine | — | — | — |
Fig.2 PH pi bon
Fig.3 Tanperati pi bon
Fig.4 Estabilite pH
Fig.5 Estabilite tèmik
Fig.6 Depo estabilite nan 25 ℃
